Adeno-associated virus (AAV) has emerged as the leading platform for Аденовирус-ассоциированный вирус (AAV) стал ведущей платформой для доставки генов in vivo
. Однако достижение высоких титров (>1E13 vg/mL) при сохранении высокой наполненности капсида остается серьезной проблемой для многих лабораторий.
В этом руководстве мы разберем ключевые параметры, влияющие на выход и качество AAV, подкрепленные нашими внутренними данными R&D.
1. Восходящая обработка: Оптимизация трансфекции
Эффективность тройной трансфекции плазмидами в клетки HEK293T является основой высокого выхода. Ключевые факторы включают соотношение плазмид, степень слияния клеток и выбор трансфекционного реагента.Совет: Никогда не допускайте, чтобы клетки HEK293T достигали 100% слияния перед трансфекцией. Перегруженные клетки демонстрируют сниженную эффективность поглощения из-за контактного торможения. Мы рекомендуем трансфекцию при 70-80% слиянии
Рисунок 1: Оптимальная морфология клеток HEK293T перед трансфекцией.
1.1 Сравнение трансфекционных реагентов
| Мы сравнили рентабельность и производительность PEI и Lipofectamine в масштабируемых условиях. | Реагент | Стоимость ($/L) | Средний титр (vg/клетка) | Цитотоксичность |
|---|---|---|---|---|
| Масштабируемость | PEI Max | Низкая | 1.5 x 10^5 | Низкая |
| Высокая | Lipofectamine | Очень высокая | 1.8 x 10^5 | Высокая |
| Низкая | Фосфат кальция | Очень низкая | 0.8 x 10^5 | Умеренная |
Сложная
2. Соображения по дизайну последовательности
Нестабильность ITR является частой причиной низких выходов. Убедитесь, что ваши ITR последовательности целы, используя рестрикционный анализ (SmaI) или секвенирование по Сэнгеру. Ниже приведена типичная структура ITR последовательности, требующая проверки.>AAV2_ITR_Left (145bp) TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA
3. Этапы очистки
- Очистка удаляет пустые капсиды и клеточные примеси. Надежный протокол обычно включает:Лизис клеток:
- Циклы замораживания-оттаивания (x3) или химический лизис с использованием Triton X-100.
- Осветление:
- Центрифугирование при 4000g в течение 20 минут.
- Фильтрация через мембрану PES 0.45µm.Обработка нуклеазой:
- Переваривание Benzonase (50 U/mL) для удаления свободной ДНК.Ультрацентрифугирование:
Градиентное центрифугирование в йодиксаноле при 350,000g в течение 2 часов.
4. Визуальный протокол: Извлечение градиента
Визуализация различных полос в ультрацентрифужной трубке может быть сложной. Посмотрите это демонстрационное видео, чтобы идентифицировать интерфейсы 40% (пустые) и 60% (полные).
5. Руководство по устранению неполадок
- Распространенные проблемы, возникающие во время производства, и их решения:Низкий титр:
- Проверьте качество плазмиды (соотношение суперскрученных > 80%) и pH PEI (должен быть 7.0).Агрегация:
- Увеличьте концентрацию соли в буфере для формулирования (например, 200mM NaCl).Осаждение:
Избегайте EDTA в буфере хранения AAV, так как он со временем разрушает целостность капсида.
