Adeno-associated virus (AAV) manufacturing is a critical bottleneck in gene therapy. High-titer and high-purity production requires rigorous optimization of the upstream transfection process.
アデノ随伴ウイルス（AAV）の製造は、遺伝子治療における重要なボトルネックです。高力価かつ高純度の生産には、上流のトランスフェクション工程の厳密な最適化が必要です。本研究では、最も広く使用されている2つのトランスフェクション試薬を比較します: ポリエチレンイミン（PEI） および リン酸カルシウム（CaPO4）
。
1. トランスフェクション試薬の導入
HEK293細胞へのトリプルプラスミドシステムの効率的な導入は、AAV生産の第一歩です。試薬の選択は、力価だけでなく完全カプシドの割合にも影響を与えます。
2. 方法の比較
| 10層CellStackで並列トランスフェクションを行いました。結果を以下にまとめます: | 特徴 | PEI Max |
|---|---|---|
| リン酸カルシウム | コスト | 中程度 |
| 非常に低い | 再現性 | 高い |
| 変動あり（pH感受性） | 細胞毒性 | 低い |
| 中程度から高い | 平均力価（vg/mL） | 2.5 x 10^12 |
1.8 x 10^12
3. ステップバイステッププロトコル（PEI）
PEIで最良の結果を得るには、以下の最適化プロトコルに従ってください:
3.1 細胞播種
トランスフェクションの24時間前にHEK293T細胞を播種し、70-80%のコンフルエンシーを達成します。過剰なコンフルエンシーはトランスフェクション効率を大幅に低下させます。
- 3.2 DNA:PEI複合体形成
- プラスミド（pAAV、pHelper、pRepCap）を1:1:1のモル比で混合します。
- DNA:PEI質量比1:3でPEI Maxを添加します。
室温で正確に15分間インキュベートします。
4. 下流精製
回収後、リサートを澄清し、イオジキサノール勾配超遠心分離法で精製しました。40%および60%の相を回収しました。
5. 結論リン酸カルシウムはコストが低いですが、PEIは優れた再現性と低い細胞毒性を提供します
